关于454焦磷酸测序的原理问题
悬赏分：20|
测序过程到底是如何进行的？我知道每有一个碱基匹配正确就会发出荧光，但我的问题如下：每个磁珠上的单克隆是同个目的基因的不同片段还是不同的目的基因，即该测序方法是能同时测序多个不同基因序列还是快速测出一个基因的序列？如果是将一个基因序列打断到不同的磁珠里，那怎样保证分别测序后各片段序列按照原基因序列顺序重新整合？该方法是否可以控制一次只结合一个碱基（如果目的序列是AAA，在T核苷酸进入时会不会一下合出3个连续碱基）？还有就是假设目的片段长为a，一个碱基进入的时间为t，那么测量整段目的片段的用时是不是就应该是4at？这真的很快吗？希望强人帮忙解释下，以上问题能答多少就答多少，不胜感激！
1，对高通量测序来说，如果是测基因组相当于做鸟枪库测序，而不是针对特定位置来测得。
2，无法保证。所以实际上每次测一个基因组，其实要获得测至少6倍以上基因组大小的数据。通过过量的数据来拼接，最后再把仍然没解决的gap用一代测序cover掉。
3，理论上，是这样。一个接一个的进入。
4，我忘记454是几色萤光了。应该是单色，还需加入洗涤同步的时间，要远大于4at。ngs快不是指并不是每个循环快，而是每次获得的信息量大。ngs每次跑的时间要数倍于一代测序，但是获得的信息量要千倍于一代测序。如果想要大量数据，自然是ngs快的多。说它价钱便宜也是同样道理。
2，无法保证。所以实际上每次测一个基因组，其实要获得测至少6倍以上基因组大小的数据。通过过量的数据来拼接，最后再把仍然没解决的gap用一代测序cover掉。
3，理论上，是这样。一个接一个的进入。
4，我忘记454是几色萤光了。应该是单色，还需加入洗涤同步的时间，要远大于4at。ngs快不是指并不是每个循环快，而是每次获得的信息量大。ngs每次跑的时间要数倍于一代测序，但是获得的信息量要千倍于一代测序。如果想要大量数据，自然是ngs快的多。说它价钱便宜也是同样道理。
好
不好其 他 回 答共2条
1楼
一个一个回答吧。
1、每个磁珠携带的是同一个片段，经过乳液PCR过后，每个磁珠携带同一个片段的大量拷贝。但是LZ不要忘了，测序的时候是N多磁珠同时进行，不同的磁珠会携带不同的片段，不然怎么能称作高通量呢~
2、高通量测序结束之后都会进行组装，这涉及到生物信息学，这里头的算法俺也不懂，但是肯定会重新组合，不然谁把DNA打断建文库就弄死谁···
3、LZ的问题说到了454的缺陷：连续的同一个碱基怎么测序。这个是缺陷，只能通过荧光的强度来辨认，比如一个A和三个A的荧光强度就不同，不过这不好解决。
4、时间问题··额，这个LZ杞人忧天了，只能这么回答。
1、每个磁珠携带的是同一个片段，经过乳液PCR过后，每个磁珠携带同一个片段的大量拷贝。但是LZ不要忘了，测序的时候是N多磁珠同时进行，不同的磁珠会携带不同的片段，不然怎么能称作高通量呢~
2、高通量测序结束之后都会进行组装，这涉及到生物信息学，这里头的算法俺也不懂，但是肯定会重新组合，不然谁把DNA打断建文库就弄死谁···
3、LZ的问题说到了454的缺陷：连续的同一个碱基怎么测序。这个是缺陷，只能通过荧光的强度来辨认，比如一个A和三个A的荧光强度就不同，不过这不好解决。
4、时间问题··额，这个LZ杞人忧天了，只能这么回答。
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