这种磷酸化与电子的转递链无关。
指在分解代谢过程中，底物因脱氢、脱水等作用而使能量在分子内部重新分布，形成高能磷酸化合物，然后将高能磷酸基团转移到ADP形成ATP的过程。例如在糖的分解代谢过程 底物水平磷酸化中，甘油醛-3-磷酸脱氢并磷酸化生成甘油酸-1，3-二磷酸，在分子中形成一个高能磷酸基团，在酶的催化下，甘油酸-1，3-二磷酸可将高能磷酸基团转给ADP，生成甘油酸-3-磷酸与ATP。 　
又如甘油酸-2-磷酸脱水生成烯醇丙酮酸磷酸时，也能在分子内部形成一个高能磷酸基团，然后再转移到ADP生成ATP。
而氧化磷酸化是在呼吸链电子传递过程中偶联ATP的生成。生物体内95%的ATP来自这种方式。