高效液相色谱法按分离机制同分液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法
1．液固色谱法 使用固体吸附剂被分离组分色谱柱上分离原理根据固定相对组分吸附力大小同而分离分离过程吸附－解吸附平衡过程常用吸附剂硅胶或氧化铝粒度5~10μm适用于分离分子量200~1000组分大多数用于非离子型化合物离子型化合物易产生拖尾常用于分离同分异构体
2．液液色谱法 使用特定液态物质涂于担体表面或化学键合于担体表面而形成固定相分离原理根据被分离组分流动相和固定相溶解度同而分离分离过程分配平衡过程
涂布式固定相应具有良好惰性；流动相必须预先用固定相饱和减少固定相从担体表面流失；温度变化和同批号流动相区别常引起柱子变化；另外流动相存固定相也使样品分离和收集复杂化由于涂布式固定相难避免固定液流失现已少采用现多采用化学键合固定相C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱
液液色谱法按固定相和流动相极性同分正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)
正相色谱法 采用极性固定相（聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相相对非极性疏水性溶剂（烷烃类正已烷、环已烷）常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等调节组分保留时间常用于分离等极性和极性较强化合物（酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）
反相色谱法 般用非极性固定相（C18、C8）；流动相水或缓冲液常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶有机溶剂调节保留时间适用于分离非极性和极性较弱化合物RPC现代液相色谱应用广泛据统计占整HPLC应用80%左右
随着柱填料快速发展反相色谱法应用范围逐渐扩大现已应用于某些无机样品或易解离样品分析控制样品分析过程解离常用缓冲液控制流动相pH值需要注意C18和C8使用pH值通常2.5~7.5（2~8）太高pH值会使硅胶溶解太低pH值会使键合烷基脱落有报告新商品柱pH 1.5~10范围操作
正相色谱法与反相色谱法比较表
正相色谱法 反相色谱法
固定相极性 高～ ～低
流动相极性 低～ ～高
组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出
从上表看出当极性等时正相色谱法与反相色谱法没有明显界线（氨基键合固定相）
3．离子交换色谱法 固定相离子交换树脂常用苯乙烯与二乙烯交联形成聚合物骨架表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）被分离组分色谱柱上分离原理树脂上电离离子与流动相具有相同电荷离子及被测组分离子进行逆交换根据各离子与离子交换基团具有同电荷吸引力而分离
缓冲液常用作离子交换色谱流动相被分离组分离子交换柱保留时间除跟组分离子与树脂上离子交换基团作用强弱有关外还受流动相pH值和离子强度影响pH值改变化合物解离程度进而影响其与固定相作用流动相盐浓度大则离子强度高利于样品解离导致样品较快流出
离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸
4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法液液色谱法分支根据被测组分离子与离子对试剂离子形成性离子对化合物非极性固定相溶解度增大从而使其分离效改善主要用于分析离子强度大酸碱物质
分析碱性物质常用离子对试剂烷基磺酸盐戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等另外高氯酸、三氟乙酸也与多种碱性样品形成强离子对
分析酸性物质常用四丁基季铵盐四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐
离子对色谱法常用ODS柱（即C18）流动相甲醇-水或乙腈-水水加入3~10 mmol/L离子对试剂定pH值范围内进行分离被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关
5．排阻色谱法 固定相有定孔径多孔性填料流动相溶解样品溶剂小分子量化合物进入孔滞留时间长；大分子量化合物能进入孔直接随流动相流出利用分子筛对分子量大小同各组分排阻能力差异而完成分离常用于分离高分子化合物组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等
色谱法基本原理
利用样品混合物各组分理、化性质差异各组分程度同分配互相溶两相当两相相对运动时各组分两相反复多次重新分配结使混合物得分离
两相固定动相称固定相；移动相称流动相
分类：
根据流动相分—气体作流动相—气相色谱——固定相液体 气-液色谱
固定相固体 气-固色谱
—液体作流动相—液相色谱——固定相液体 液-液色谱
固定相固体 液-固色谱
—当流动相接近临界温度和压力下工作液体时——超临界色谱
根据固定相附着方式
—固定相装圆柱管—柱色谱
—固定相涂敷玻璃或金属板上—薄膜色谱（平板色谱）
—液体固定相涂纸上—纸色谱（平板色谱）
根据分离机理
—分配色谱—样品组分分配系数同
—吸附色谱— 样品组分对固定相表面吸附力同
—体积排阻色谱—利用固定相孔径同把样品组分按分子大小分开
—离子交换色谱—同离子与固定相商相反电荷间作用力大小同
根据极性
—流动相极性＞固定相极性-反相色谱
—流动相极性＜固定相极性-正相色谱
气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定有机化合物而HPLC则适合于分析些用气相色谱难分析物质挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差物质所HPLC应用范围已经远远超过气相色谱

、吸附色谱（adsorption chromatography）
又叫液固色谱法：流动相液体固定相固体
分离原理：固定相固体吸附剂吸附剂多孔性微粒物质表面有吸附心样品组分与流动相竞争吸附 心各组分吸附能力同使组分固定相产生保留时间同和实现分离
固定相： 固定相通常强极性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂活性硅胶常用
流动相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂混合物正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲 烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等
应用： 对于极性结构异构体分离和族分离仍有效方法农药异构体分离、石油烷、烯、芳烃 分离 缺点容易产生对称峰和拖尾现象
二、分配色谱
原理： 固定液机械吸附惰性载体上样品分子依据们流动相和固定相间溶解度同分别进入两相分配而实现分离
固定相：种极性或非极性固定液吸附惰性固相载体上全多孔微粒硅胶吸附剂
根据极性同分类：正相分配色谱—固定相载体上涂布极性固定液；
流动相非极性溶剂；
分立极性较强水溶性样品；
弱极性组分先洗脱出来
反相分配色谱—固定相载体上涂布非极性或弱极性固定液；
流动相极性溶剂；
强极性组分先洗脱出来
液-液分配色谱固定相固定液体往往容易溶解流动相去所重现性差且能进行梯度洗脱已经大人们所采用
三、键合相色谱
考虑分配色谱法固定液缺点因此各种同有机关能团通过化学反应共价结合固定相惰性载体上固定相会溶解流动相去了
键合固定相优点：○ 对极性有机溶剂有良好化学稳定性
○使色谱柱柱效高、寿命长
○实验重现性好
○几乎适于各种类相有机化合物分离尤其k’宽范围样品
○梯度洗脱
根据极性同分类：正相键合相色谱—固定相极性＞流动相极性
固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团有机分子
适于分离脂荣、水溶性极性、强极性化合物
反相键合相色谱—固定相极性＜流动相极性
固定相：烷基、苯基等非极性有机分子常用ODS柱或C18柱 典型代表其极性小
适于分离非机性、弱极性离子型样品
当今液相色谱主要分离模式
正相HPLC（normal phase HPLC）：
由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成HPLC体系其代表性固定相改性硅胶、氰基柱等代表性流动相正己烷吸附色谱也属正相HPLC
反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非极性固定相和极性流动相所组成液相色谱体系与正相HPLC体系正好相反其代表性固定相十八烷基键合硅胶(ODS柱Octa Decyltrichloro Silane)代表性流动相甲醇和乙腈
四、体积排阻色谱（SECsize exclusion chromatograghy）
（又称凝胶色谱和分子筛色谱）
原理： 多孔凝胶（葡萄糖琼脂糖硅胶聚丙烯酰胺等）作固定相依据样品分子量大小达分离目 大分子进入凝胶孔洞沿多孔凝胶胶粒间隙流出先被洗脱；小分子进入大部分凝胶孔洞 柱被强滞留被洗脱
根据样品性质分类：凝胶过滤（GFC）—用于分析水溶性样品多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核 苷酸、多糖
凝胶渗透（GPC）—用于分析脂溶性样品测定高聚物分子量
SEC主要依据分子量大小进行分离因此与样品、流动相间相互作用无关因此采用改变流动相组成来改善分离度
五、离子交换色谱
（ion exchange chromatography, IEC）
分离原理：使用表面有离子交换基团离子交换剂作固定相带负电荷交换基团（磺酸基和羧酸基）用于阳离子分离；带正电荷交换基团（季胺盐）用于阴离子分离同离子与交换基作用力大小同树脂保留时间长短同从而被相互分离