高效液相色谱法经典色谱法基础上引用了气相色谱理论技术上流动相改高压输送（高输送压力达4.9107Pa）;色谱柱特殊方法用小粒径填料填充而成从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数达几万或几十万）；同时柱连有高灵敏度检测器对流出物进行连续检测
特点
1．高压：液相色谱法液体流动相（称载液）液体流经色谱柱受阻力较大了迅速地通过色谱柱必须对载液施加高压般达150～350×105Pa
2. 高速：流动相柱内流速较经典色谱快得多般达1～10ml/min高效液相色谱法所需分析时间较之经典液相色谱法少得多般少于 1h
3. 高效：近来研究出许多新型固定相使分离效率大大提高
4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度检测器进步提高了分析灵敏度荧光检测器灵敏度达10-11g另外用样量小般几微升
5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法比较：气相色谱法虽具有分离能力好灵敏度高分析速度快操作方便等优点受技术条件限制沸点太高物质或热稳定性差物质都难于应用气相色谱法进行分析而高效液相色谱法只要求试样能制成溶液而需要气化因此受试样挥发性限制对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 上）有机物（些物质几乎占有机物总数 75% ～ 80% ）原则上都应用高效液相色谱法来进行分离、分析 据统计已知化合物能用气相色谱分析约占20%而能用液相色谱分析约占70～80%
高效液相色谱按其固定相性质分高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱及高效聚焦液相色谱等类型用同类型高效液相色谱分离或分析各种化合物原理基本上与相对应普通液相层析原理相似其同之处高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好且须色谱仪进行
高效液相色谱法主要类型及其分离原理
根据分离机制同高效液相色谱法分下述几种主要类型：
1 ．液 — 液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)
流动相和固定相都液体流动相与固定相之间应互相溶（极性同避免固定液流失）有明显分界面当试样进入色谱柱溶质两相间进行分配达平衡时服从于下式：
式cs—溶质固定相浓度；cm--溶质流动相浓度； Vs—固定相体积；Vm—流动相体积LLPC与GPC有相似之处即分离顺序取决于KK大组分保留值大；也有同之处GPC流动相对K影响大LLPC流动相对K影响较大
a. 正相液 — 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相极性小于固定液极性
b. 反相液 — 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相极性大于固定液极性
c. 液 — 液分配色谱法缺点：尽管流动相与固定相极性要求完全同固定液流动相仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时机械冲击力会造成固定液流失上世纪70年代末发展化学键合固定相（见）克服上述缺点现应用广泛（70~80%）
2 ．液 — 固色谱法
流动相液体固定相吸附剂（硅胶、氧化铝等）根据物质吸附作用同来进行分离其作用机制：当试样进入色谱柱时溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性心发生竞争吸附（未进样时所有吸附剂活性心吸附S）表示下：
Xm + nSa ====== Xa + nSm
式：Xm--流动相溶质分子；Sa--固定相溶剂分子；Xa--固定相溶质分子；Sm--流动相溶剂分子
当吸附竞争反应达平衡时：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
式：K吸附平衡常数[讨论：K越大保留值越大]
3 ．离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)
IEC离子交换剂作固定相IEC基于离子交换树脂上电离离子与流动相具有相同电荷溶质离子进行逆交换依据些离子交换剂具有同亲和力而们分离
阴离子交换剂例其交换过程表示下：
X-(溶剂) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂)
当交换达平衡时：
KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]
分配系数：
DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]
[讨论：DX与保留值关系]
凡溶剂能够电离物质通常都用离子交换色谱法来进行分离
4 ．离子对色谱法(Ion Pair Chromatography)
离子对色谱法种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反离子 ( 称对离子或反离子 ) 加流动相或固定相使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物从而控制溶质离子保留行其原理用下式表示：
X+水相 + Y-水相 === X+Y-有机相
式：X+水相--流动相待分离有机离子（也阳离子）；Y-水相--流动相带相反电荷离子对（氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y---形成离子对化合物
当达平衡时：
KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相
根据定义分配系数：
DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相
[讨论：DX与保留值关系]
离子对色谱法(特别反相)发解决了往难分离混合物分离问题诸酸、碱和离子、非离子混合物特别些生化试样核酸、核苷、生物碱及药物等分离
5 ．离子色谱法(Ion Chromatography)
用离子交换树脂固定相电解质溶液流动相电导检测器通用检测器消除流动相强电解质背景离子对电导检测器干扰设置了抑制柱试样组分分离柱和抑制柱上反应原理与离子交换色谱法相同
阴离子交换树脂（R-OH）作固定相分离阴离子（Br-）例当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时发生下交换反应（洗脱反应交换反应逆过程）：
抑制柱上发生反应：
R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O
R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-
见通过抑制柱洗脱液转变成了电导值小水消除了本底电导影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应酸H+Br-用电导法灵敏检测
离子色谱法溶液阴离子分析佳方法也用于阳离子分析
6 ．空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography)
空间排阻色谱法凝胶 (gel) 固定相类似于分子筛作用凝胶孔径比分子筛要大得多般数纳米数百纳米溶质两相之间靠其相互作用力同来进行分离而按分子大小进行分离分离只与凝胶孔径分布和溶质流动力学体积或分子大小有关试样进入色谱柱随流动相凝胶外部间隙及孔穴旁流过试样些太大分子能进入胶孔而受排阻因此直接通过柱子首先色谱图上出现些小分子进入所有胶孔并渗透颗粒些组分柱上保留值大色谱图上出现
高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、．分离系统、检测系统和数据处理系统下面分别叙述其各自组成与特点
1．进样系统
般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作进样量恒定对提高分析样品重复性有益
2．输液系统
该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分高压泵般压强l．47～4．4X107Pa流速调且稳定当高压流动相通过层析柱时降低样品柱扩散效应加快其柱移动速度对提高分辨率、回收样品、保持样品生物活性等都有利流动相贮存错和梯度仪使流动相随固定相和样品性质而改变包括改变洗脱液极性、离子强度、PH值或改用竞争性抑制剂或变性剂等使各种物质（即使仅有基团差别或同分异构体）都能获得有效分离
3.分离系统
该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等色谱柱般长度10～50cm（需要两根连用时二者之间加连接管）内径2～5mm由"优质锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成住内装有直径5～10μm粒度固定相（由基质和固定液构成）．固定相基质由机械强度高树脂或硅胶构成们都有惰性（硅胶表面硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径达1000?）和比表面积大特点加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱固定相制备样）或者用化学法偶联各种基因（磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链烷基等）或配体有机化合物因此类固定相对结构同物质有良好选择性例多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）把成纤维细胞种糖蛋白分离出来
另外固定相基质粒小柱床极易达均匀、致密状态极易降低涡流扩散效应基质粒度小微孔浅样品微孔区内传质短些对缩小谱带宽度、提高分辨率有益根据柱效理论分析基质粒度小塔板理论数N越大也进步证明基质粒度小会提高分辨率道理
再者高效液相色谱恒温器使温度从室温调60C通过改善传质速度缩短分析时间增加层析柱效率
4．检测系统
高效液相色谱常用检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种
（1）紫外检测器
该检测器适用于对紫外光（或见光）有吸收性能样品检测其特点：使用面广（蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均使用）；灵敏度高（检测下限10-10g／ml）；线性范围宽；对温度和流速变化敏感；检测梯度溶液洗脱样品
（2）示差折光检测器
凡具有与流动相折光率同样品组分均使用示差折光检测器检测目前糖类化合物检测大多使用此检测系统系统通用性强、操作简单灵敏度低（检测下限10-7g／ml）流动相变化会引起折光率变化因此既适用于痕量分析也适用于梯度洗脱样品检测
（3）荧光检测器
凡具有荧光物质定条件下其发射光荧光强度与物质浓度成正比因此检测器只适用于具有荧光有机化合物（多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）测定其灵敏度高（检测下限10-12～10-14g／ml）痕量分析和梯度洗脱作品检测均采用
（5）数据处理系统
该系统对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作使样品分离、制备或鉴定工作能正确开展